台式核磁在疫苗质量保障中的应用

1 背景介绍

疫苗是促进人类健康最有效的方法之一。疫苗的种类很多，按照制造工艺的不同，可分为灭活疫苗、重组蛋白疫苗、减毒疫苗、病毒载体疫苗以及核酸（包括DNA和mRNA）疫苗等。持续开发和生产稳定、安全、有效的疫苗，对人类疾病防治和社会经济发展有着深远的影响。

佐剂是添加到疫苗抗原中用以增强免疫反应的物质。氢氧化铝和磷酸铝等铝盐，是商业疫苗中最常用的佐剂。尽管其发挥作用的详细机制仍然未知，但是因为良好的安全性和强大的增敏能力，它们得到了广泛的使用。铝佐剂自1926年首次被引入疫苗，至今已有近百年的应用历史。

2 遇到的问题

铝佐剂疫苗对冷冻敏感，因此对储存温度范围有比较严格的要求，通常是2-8 ⁰C。低于推荐温度进行储存或冷链运输，疫苗可能发生抗原降解、铝佐剂颗粒聚集或其它分子结构改变，最终导致失效，必须按要求做弃用处理。因冻融造成的产品改变，需要有相应的手段进行检测分析。

此外，铝佐剂疫苗在实际使用中，是配制成了水悬浮液。氢氧化铝等铝盐，会首先形成不溶的纳米级初级颗粒，然后凝聚成不规则形状的微米级颗粒。这些铝盐颗粒，无论是否吸附了抗原，密度都比水重，因此容易沉淀。这种沉积趋势也会给疫苗产品的生产和使用带来潜在的质量问题。

世界卫生组织推荐对可疑批次疫苗采用“振摇法”来检测。然而，这个方法依赖于人的肉眼观察，带有较强的主观性，并且疫苗体积和容器上的标签都会对观测造成影响。

3 先进的MQC+时域核磁检测方案

Briggs等人利用牛津仪器时域核磁共振分析仪MQC+，对三种商品化的铝佐剂疫苗进行了冻融研究。每一种疫苗各取十瓶，分为两组。其中，编号1-5的小瓶置于5 ⁰C，编号6-10的小瓶则先于-18 ⁰C冷冻，再于5 ⁰C融化。研究人员发现，经-18 ⁰C 处理后，Daptacel疫苗的9号小瓶不知什么原因未能冻住结冰（图1A），所有Engerix-B疫苗都被冻成了固态（图1B），而VAQTA疫苗则全部保持液体状态（图1C）。此外，研究人员也指出，小瓶上贴的标签十分不利于目视观察（图1D）。

所有经过预处理的小瓶，直接放入MQC+核磁共振分析仪，利用CPMG脉冲序列，测定疫苗中水的弛豫速率R₂(¹H₂O)。图2给出了这三种商品化铝佐剂疫苗的R₂(¹H₂O)测定结果。可以看到，Daptacel疫苗1-5号小瓶的R₂(¹H₂O)数值约为2.5 s^-1，9号小瓶由于没有真正经历冻融变化，其R₂(¹H₂O)数值与1-5号相当；其它几个小瓶（6-8和10号）发生过冻融，它们的R₂(¹H₂O)数值明显降低，大约只有1.2 s^-1。Engerix-B疫苗1-5号小瓶的R₂(¹H₂O)数值在1.25 s^-1左右，而6-10号小瓶的数值则在0.7-0.9 s^-1之间，两组样品存在显著差异。VAQTA疫苗1-5号和6-10号小瓶虽然经过了不同预处理，但由于都一直保持液体状态，无冻融变化，其R₂(¹H₂O)数值都约为3.2 s^-1，没有差异。

从以上实验数据可以知道，若采用世界卫生组织推荐的“振摇法”，如果测试人员在检测Daptacel疫苗时，从6-10号组别中碰巧随机选到了9号瓶，就会得出这一批次疫苗没有发生冻融，给出建议使用的错误结论，这将对疫苗接种者带来难以预知的风险。

因冻融造成的分子改变，也可以利用MS、DLS和HPLC等手段进行分析。不过这些技术都是侵入式的，对疫苗的完整性会造成破坏。核磁共振技术可以对铝佐剂疫苗的冻融情况进行检测，并且能够给出非常清晰的判断。该方法简单迅速，对每个小瓶的测试时间仅需10-30秒，而且是一种非侵入式的无伤检测技术。该方法将“批接受/拒绝”转变成了“瓶接受/拒绝”，可以有效保证每一支疫苗的质量。

• 疫苗灌装、沉淀和重悬分析

铝佐剂疫苗中的铝盐颗粒容易沉淀，这种特性会给疫苗产品的生产和使用带来不利影响。比如在生产灌装环节，如果未经充分重悬，疫苗中铝盐和抗原等物质的浓度偏差可以高达50%。浓度过低会显著影响疫苗效力，浓度过高可能引发剧烈免疫反应，带来严重后果。图3显示了两种商品化疫苗中铝佐剂的沉积特性，左图使用的铝盐是氢氧化铝，右图使用的是磷酸铝。

Taraban等人采用时域核磁共振分析仪MQC+，对这两种商品化疫苗不同浓度铝佐剂在悬浮、沉淀和重悬状态下进行了水弛豫速率R₂(¹H₂O)的测定（图4）。数据显示，沉淀状态因为缺乏铝盐和水的相互作用，弛豫速率R₂(¹H₂O)数值与铝盐浓度无关。非沉淀状态下，R₂(¹H₂O)数值和铝盐浓度具有很好的线性关系。值得一提的是，充分重悬状态的R₂(¹H₂O)数值，可以完全恢复到跟初始悬浮态一样的水平。这为评估同一批次疫苗灌装的一致性，提供了重要依据和技术基础。由于实验中铝盐浓度范围为0.1-5 mg/mL，基本覆盖了真实世界中可能出现的浓度误差，该方法可以用于铝盐浓度和灌装偏差的分析追踪。