在简单的情况下，组成¹H核磁共振信号的峰数，与相邻碳原子连接的质子数相关。因此，可以对剩余五个未归属信号进行如下推论。

δ_H 3.7 ppm处的信号由四个峰组成，并且积分为一个质子，这意味着一个CH基团与CH₃基团相邻。布洛芬中唯一与此相一致的质子是3号。

δ_H 2.4、1.5和0.9 ppm处有三个信号，每个信号由两个峰（双峰）组成，表明它们紧邻一个CH基团。δ_H 0.9 ppm处的信号积分为六个质子，表明两个CH₃基团，而两个甲基基团11，是布洛芬中唯一可能的质子。δ_H 2.4 ppm处的信号积分为两个质子，因此对应于与CH相连的CH₂基团，与布洛芬的9相一致。δ_H 1.5 ppm处的剩余双重峰与δ_H 1.9 ppm处的多重峰（意味着具有复杂多重性的信号）重叠。对积分进行仔细检查，可以确定该双重峰对应于三个质子，因此是与布洛芬中的3位CH相连的CH₃的信号。

通过排除过程，δH 1.9 ppm处的多重峰可归属于10位CH基团。该信号与两个CH₃和一个CH₂基团相连，可以解释这种复杂的耦合裂分模式。

虽然在这个案例中不需要指认质子核磁共振谱，但是从¹H核磁共振谱中可以获得额外信息，以帮助归属信号。

当原子核之间发生耦合，导致在核磁共振波谱中观察到多重峰时，可以通过多重峰中各峰间的分离距离来测量耦合的大小（以Hz为单位）。由于耦合是一个常数，因此无论选择哪一对信号，都将测量到相同的值。这可以应用于核磁共振波谱中直接耦合的信号配对。例如，δ_H 3.7 ppm的四重峰被指认为3，其耦合常数³J_HH为7.1 Hz，而δ_H 2.4、1.5和0.9 ppm的双重峰的耦合常数分别为³J_HH 6.7、7.2和6.3 Hz，这表明δ_H 3.7ppm的信号与δ_H 1.5 ppm的信号相互耦合（已被指定为4）²。使用二维波谱可以避免这种可能耗时的测量和耦合配对过程，从而帮助谱峰归属。详见后文¹H-¹H COSY波谱内容。

碳-13核磁共振

质子是一个高旋磁比的原子核，天然丰度接近100%，是核磁共振波谱中“最好的”原子核。相比之下，碳的情况更为复杂。碳最丰富的同位素碳-12是没有核磁共振活性的。相反，碳核磁共振谱是测量碳-13的，但它只有1.1%的天然丰度，并且比质子的旋磁比低。由于碳-13只有质子可接受性的1/5870，因此需要更高的样品浓度和更长的测量时间。

碳-13核磁共振波谱如图3所示。碳谱看起来似乎比质子波谱简单，所有信号都显示为单个尖峰。这是因为所有的碳-质子耦合都通过质子去耦被去除了。

该谱被称为质子去耦碳-13核磁共振谱，简化为¹³C{¹H} NMR波谱³。

然而，如前所述，布洛芬中有十种化学上独特的碳环境，但是其核磁共振谱图中仅观察到九种信号，表明两个信号重叠成为了一个单峰。如果这是一个质子核磁共振谱，通过评估峰的积分面积，可以很容易地识别任何重叠信号。但是质子去耦碳-13核磁共振波谱是一个例外，即峰（信号）的积分直接对应于产生该信号的原子核数目这一规则并不适用⁴。从¹³C{¹H}核磁共振谱的信号强度可以推断出一些信息。一般来说，不直接与任何质子结合的碳原子（季碳）的信号强度，远低于直接与一个或多个质子结合的碳原子信号。

δ_C 181.4、140.9和137.2 ppm的信号，以及氘代氯仿溶剂产生的信号（1:1:1三重峰）都可以观察到这一点。

通过考虑这些碳信号的化学位移，可以将δ_C 181.4 ppm处的信号指认为羰基，从而归属为羧酸碳2。

而δ_C 140.9和137.2 ppm处的信号与芳香碳一致，因此归属为季碳5和8。

在芳香区的δ_C 129.5和127.4 ppm位置，两个更强的信号可被指认为芳香CH碳6和7。

碳-13核磁共振谱中的其余四个信号与烷基CH_X碳一致，化学位移较低的信号可能对应末端甲基CH₃基团。这些信号的彻底归属还需要其他额外的信息，而这些信息无法从简单的一维¹³C{¹H}核磁共振谱中获得。

二维核磁共振波谱

到目前为止，只考虑了简单的一维核磁共振谱。然而，核磁共振波谱学的一大优势是可以使用种类多样的不同脉冲序列，从而获得不同的波谱。一类重要的脉冲序列是给出二维相关谱。这些情况下，可以通过检测到的交叉峰，对应相应一维波谱中观察到的信号之间的相互作用（例如通过J耦合）。以下示例演示了引入第二维度如何解决重叠带来的复杂问题，并显著简化了归属过程，实现了复杂分子的快速识别。

¹H-¹H相关谱

质子-质子相关谱（COSY）是要考虑的第一个二维谱，以布洛芬为例，如图4所示。

注意，在x和y轴上，显示了前面讨论的简单质子谱。实际的二维波谱由图4中红色的交叉峰组成。

作为同核相关谱，COSY谱沿对角线对称，信号直接耦合时出现非对角线交叉峰。通常，对于在一维谱中观察到J耦合的信号对，将会在COSY谱中观察到交叉峰。

在布洛芬案例中，4-CH₃和3-CH可在COSY谱中观察到交叉峰。另外，在9-CH₂、10-CH和11-CH₃三个信号之间可以观察到交叉峰。这也是一个很好的例子，说明在一维谱中不能分辨的J耦合，或可在二维COSY谱中看到交叉峰，如9-CH₂和11-CH₃之间的四键相互作用。

¹H-¹³C相关谱

除了像COSY这样的质子-质子相关实验外，观测质子-碳相关的脉冲序列也有助于信号的归属过程。最常用的两种是，允许观察质子-碳单键关联的且带多线编辑的异核单量子相干序列（HSQC-ME），以及允许观察质子-碳长程关联的异核多键相干序列（HMBC）。

¹H-¹³C HSQC-ME和¹H-¹³C HMBC波谱（图5和图6）均在水平方向显示质子谱，而在垂直方向显示碳谱。图5中布洛芬HSQC-ME波谱的交叉峰对应于质子-碳单键相关。

该波谱还经过多线编辑，提供了CH_X环境多重性的信息。CH和CH₃以正相位的交叉峰显示（图5中为红色），CH₂则以负相位的交叉峰呈现（图5中为蓝色）。

从HSQC-ME谱中应该注意到的第一件事是，它解释了为什么预期的十个碳信号，在一维¹³C{¹H}谱中只能观察到九个信号。δ_C 45.2 ppm处的信号与两个质子信号相关：3-CH（δ_H 3.69 ppm）和9-CH₂（δ_H 2.44 ppm），证实了直接连接到芳香环的两个碳原子，具有极为相近的¹³C化学位移。

布洛芬的¹H-¹³C HMBC波谱如图6所示。观察到的交叉峰对应于两键或三键的质子-碳关联。HMBC谱让布洛芬的完整结构归属/解析得以实现。

例如，在δ_H 3.69 ppm处的3-CH信号，与δ_C 127.4 ppm处的芳香族CH和δ_C 137.2 ppm处的芳香族季碳相关，可以分别确定这些信号的来源为6和5。通过对所有信号的系统分析，可以推断碳链的连接，并完成全谱归属/结构解析。

布洛芬谱图归属

通过分析所有这些波谱，可以在一维谱中实现信号的完全指认。布洛芬的质子和碳-13核磁共振谱的完整归属如下。

δH (60 MHz, 40°C, CDCl3): 11.94 (1H, s, 1-OH), 7.46 – 6.83 (4H, m, 6,7-C6H4), 3.69 (1H, q, 3JHH 7.1, 3-CH), 2.44 (2H, d, 3JHH 6.7, 9-CH2), 1.89 (1H, qt, 3JHH 6.7, 3JHH 6.3, 10-CH), 1.48 (3H, d, 3JHH 7.2, 4-CH3), 0.88 (6H, d, 3JHH 6.3, 11-CH3).

δC (15 MHz, 40°C, CDCl3): 181.36 (1C, s, 2-C=O), 140.93 (1C, s, 8-CH), 137.19 (1C, s, 5-CH), 129.51 (2C, s, 7-CH), 127.43 (2C, s, 6-CH), 45.21 (2C, s, 3-CH & 9-CH2), 30.25 (1C, s, 10-CH), 22.51 (2C, s, 11-CH3), 18.21 (1C, s, 4-CH3).

其它二维相关谱

COSY、HSQC和HMBC实验有助于NMR谱图的归属和化合物的解析，但它们并不是X-Pulse上仅有的二维脉冲序列。总相关谱（TOCSY）序列不仅可以观察COSY谱中可见的直接质子-质子耦合，还可以观察到通过自旋体系的间接质子-质子耦合。相关内容在我们的应用笔记 “自旋锁定：总相关谱（TOCSY）” 中进行了详细介绍和讨论。

核Overhauser增强谱（NOESY）可以显示出源自空间相互作用产生的交叉峰⁵，并可据此确定分子的三维结构。

总结

利用牛津仪器X-Pulse宽带台式核磁共振波谱仪，通过一系列一维和二维质子以及碳-13核磁共振脉冲序列，可以对多种小分子进行完整的结构归属/解析。当X-Pulse与X-Auto自动进样器结合使用时，对文中所有演示实验可实现一次性多达25个样品的自动信号采集。